FlowJo v10 中文教程：从入门到精通

第一部分：FlowJo 核心概念

在开始操作之前，理解 FlowJo 的几个核心概念至关重要,这会让你的分析之路事半功倍。

1. 工作区

   • 是什么： FlowJo 的主界面,是你进行所有分析的地方。
   • 包含： 左侧是实验节点树，中间是样本列表，右侧是分析视图（图表和表格）。

2. 实验节点树

   • 是什么： 位于工作区左侧,以树状结构展示了你的所有实验。
   • 结构：
     • 顶级节点: 你的实验文件夹或数据来源。
     • 实验节点: 一个完整的实验，包含所有样本和它们对应的 .fcs 文件。
     • 样本节点: 单个的 .fcs 文件,是你分析的基本单位。
     • 群体: 你在样本中根据 gating 策略定义的细胞亚群，群体是 FlowJo 的核心，它包含了 gating 路径和统计数据。

3. 样本

   • 是什么： 一个 .fcs (Flow Cytometry Standard) 文件，包含了流式细胞仪采集到的所有细胞事件（数据点）。

4. 群体

   
   （图片来源网络，侵删）
   • 是什么： 通过在图上画门而定义的细胞亚群，从“淋巴细胞门”中再分出“T细胞门”。
   • 层级关系： 群体具有父子关系，子群体的统计数据（如细胞数、百分比）是基于其父群体的。

5. Gating 策略

   • 是什么： 一系列连续的 gating 操作，用于从原始数据中一步步筛选出你感兴趣的细胞群，一个好的 gating 策略应该是清晰、可重复的。

6. 模板

   • 是什么： 一个应用了特定 gating 策略和图表设置的样本，你可以将这个模板应用到其他具有相同标记的样本上，实现批量、标准化的分析。

第二部分：基础操作流程

本部分将带你走完一个完整的流式数据分析流程。

步骤 1：导入数据

1. 打开 FlowJo,进入工作区。
2. 点击菜单栏的 File -> Import -> Folder...。
3. 在弹出的窗口中，选择包含你所有 .fcs 文件的文件夹，FlowJo 会自动扫描该文件夹下的所有 .fcs 文件。
4. 命名你的实验：在 "Workspace Name" 中给你的实验起一个名字，"小鼠脾脏淋巴细胞分析"。
5. 点击 OK，FlowJo 会将文件夹下的所有 .fcs 文件作为样本导入实验节点树中。

步骤 2：初步查看和补偿

1. 查看样本： 在左侧的实验节点树中，双击任意一个样本节点，中间的样本列表会显示该样本的详细信息,右侧会自动弹出第一个参数的直方图图。
2. 设置补偿：
   • 流式细胞仪使用不同颜色的激光检测不同荧光，但荧光之间可能会有光谱重叠,需要进行补偿校正。
   • 单染管： 你需要有用于补偿的单染样本（每个管只标记一种抗体）。
   • 在实验节点树中，按住 Ctrl 或 Cmd 键，同时选中所有单染管和未染管。
   • 右键点击选中的样本，选择 Create Compensation Matrix。
   • FlowJo 会自动识别单染管，并计算一个补偿矩阵，检查一下 "Compensation" 窗口中的图,确保每个单染管的阳性峰都正确地落在其自己的轴上。
   • 点击 Apply，将这个补偿矩阵应用到所有选中的样本（通常也包括你的实验样本）。

步骤 3：Gating 分群（核心步骤）

我们以一个典型的淋巴细胞免疫分型为例：

1. 选择起始样本： 选择一个代表性的样本（通常是阳性对照或样本组中的一个）开始 gating，完成一个样本的 gating 策略后,可以将其作为模板应用到其他样本。

2. 画第一道门 - FSC-A vs SSC-A (排除碎片和死细胞)

   • 在右侧视图中，点击 Graphs 标签，选择 FSC-A (前向角散射，反映细胞大小) 和 SSC-A (侧向角散射，反映细胞颗粒度)。
   • 在图上画一个“P1”门，圈出细胞分布集中的区域,通常是淋巴细胞群。
   • 双击这个门，命名为 "Lymphocytes" (淋巴细胞)。

3. 画第二道门 - Singlets (排除粘连细胞)

   • 为了排除两个或多个细胞粘在一起的情况，我们需要看双联体/三联体。
   • 点击 Graphs 标签，选择 FSC-H (高度) 和 FSC-W (宽度)。
   • 在图上画一个“P2”门,圈出对角线上单个细胞的区域。
   • 双击命名为 "Singlets" (单细胞)。
   • 关键操作： 右键点击 "Singlets" 群体，选择 Subset -> Parent，你的分析对象就从 "All Events" 变成了 "Singlets" 群体。

4. 画第三道门 - Live/Dead Cells (排除死细胞)

   • 如果你的实验使用了染死细胞的染料（如 Zombie Aqua, DAPI）,这一步非常重要。
   • 点击 Graphs 标签，选择 FSC-A 和你的死细胞染料通道（如 Aqua-A）。
   • 在活细胞区域画一个门,圈出染料阴性的细胞。
   • 双击命名为 "Live Cells" (活细胞)。
   • 同样，右键点击 "Live Cells"，选择 Subset -> Parent。

5. 画第四道门 - 主要细胞亚群 (如 T, B, NK 细胞)

   • 现在我们的分析对象是 "Live Singlets"。
   • 点击 Graphs 标签，选择 CD3 (T细胞标志物) 和 CD19 (B细胞标志物)。
   • 你会看到四个象限：
     • CD3+ CD19-: T 细胞
     • CD3- CD19+: B 细胞
     • CD3- CD19-: 可能是 NK 细胞或其他细胞
   • 使用 Quadrant 工具（工具栏上的十字图标）来画象限门。
   • 依次双击每个象限，命名为 "T cells", "B cells", "NK cells"。

步骤 4：创建图表

1. 选择图表类型： 在右侧工具栏或菜单栏 Graphs 中，选择你想要的图表类型，如 Dot Plot (点图), Contour Plot (等高线图), Histogram (直方图)。
2. 选择要展示的群体和参数：
   • 在左侧的实验节点树中，按住 Shift 键，依次点击你想要展示的群体（"T cells", "B cells", "NK cells"）。
   • 在右侧的图表区域，点击 X 和 Y 轴的下拉菜单，选择你想要分析的参数（CD4 和 CD8）。
   • FlowJo 会自动为每个群体生成一张图表。

步骤 5：创建并应用模板

1. 创建模板：

   • 在左侧实验节点树中，右键点击你已经完成 gating 的起始样本。
   • 选择 Create Template。
   • 在弹出的窗口中，勾选你想要包含在模板中的所有群体（从 "Lymphocytes" 到最后的 "NK cells" 等）。
   • 点击 OK,该样本节点旁边会出现一个模板图标。

2. 应用模板：

   • 在左侧实验节点树中，按住 Shift 键，选中所有你想要应用此模板的样本。
   • 右键点击选中的样本，选择 Apply Template。
   • 选择你刚刚创建的模板，点击 OK。
   • FlowJo 会自动为所有选中的样本执行相同的 gating 策略,并生成相应的图表和统计数据。

步骤 6：查看和导出结果

1. 查看统计数据： 在右侧视图下方，点击 Table 标签，FlowJo 会自动生成一个表格，显示每个样本、每个群体的细胞数和百分比。
2. 导出图表：
   • 右键点击你想要导出的图表，选择 Export -> Graph as Image...。
   • 可以选择导出为 PNG, TIFF, JPG 等格式,设置分辨率和尺寸。
3. 导出表格：
   • 右键点击 Table 标签页，选择 Export -> Table as Excel... 或 Table as Text...。
   • 可以轻松地将数据导出到 Excel 进行后续统计分析。
4. 生成报告：
   • FlowJo 可以生成专业的 PDF 报告，通过 Report 功能，可以自定义报告的布局、包含哪些图表和表格。

第三部分：高级功能与技巧

当你掌握了基础操作后，可以探索以下高级功能,它们能极大地提升你的分析效率和深度。

1. 群组

   • 是什么： 将功能相似的样本（如同一处理组的所有小鼠）组织在一起。
   • 用途： 方便进行组间比较,统计图表会自动按组显示不同颜色。
   • 操作： 在实验节点树中，选中要归为一组的样本，右键选择 Group -> New Group...,然后命名。

2. 平台

   • 是什么： 一个更高级的群组,用于管理不同标记组合但实验目的相同的样本。
   • 用途： 当你有多组样本，每组使用了不同的抗体面板时,平台可以帮你统一管理这些不同的实验。

3. 统计

   • 是什么： FlowJo 内置了丰富的统计工具。
   • 操作： 右键点击一个群体，选择 Statistics -> Add Statistics，可以添加 Median, Mean, Geometric Mean, % of Parent, % of Grandparent 等指标到表格中。

4. 串联门

   • 是什么： 一个群体，其定义依赖于另一个样本的 gating 结果，用某个荧光微球（bead）的标准曲线来设定另一个样本的阳性阈值。
   • 用途： 用于实现跨样本的标准化 gating。

5. 脚本与插件

   • 是什么： FlowJo 支持使用 JavaScript 编写脚本,实现高度自动化的分析流程。
   • 用途： 对于重复性极高、步骤复杂的分析，编写脚本可以一劳永逸，一些第三方插件（如 OpenCyto, t-SNE）也通过脚本形式扩展了 FlowJo 的功能。

第四部分：学习资源推荐

1. FlowJo 官方资源（英文，但质量最高）：

   • 官方文档: https://docs.flowjo.com/ - 最权威的参考手册。
   • 官方博客: https://blog.flowjo.com/ - 包含大量技巧、教程和行业新闻。
   • YouTube 频道: 搜索 "FlowJo LLC"，有大量视频教程,从入门到高级应有尽有。

2. 中文社区与资源：

   • Bilibili (B站): 搜索 "FlowJo 教程"，有很多国内用户分享的视频教程,非常直观。
   • 微信公众号: 关注一些生物信息学或流式细胞术相关的公众号，有时会推送 FlowJo 的使用技巧。
   • 专业论坛: 在丁香通、小木虫等生物科研论坛的流式细胞版块,可以提问和交流。

学习 FlowJo 的最佳路径是：理解核心概念 -> 跟随教程动手操作 -> 分析自己的真实数据 -> 探索高级功能，不要害怕尝试，FlowJo 的操作是“非破坏性”的，你可以随时撤销 gating 操作,祝你学习顺利！